Статья

Результаты экспериментального изучения свойств пептида IPH- AVN как средства для нормализации функций сосудистой системы. Отчёт.

В настоящее время большой интерес представляет изучение свойств пептидов [Dudgeon W.D. et al., 2016]. Пептиды имеют ту же структуру, что и белки (протеины), но размер этих молекул меньше. Важно также отметить, что короткие пептиды, являясь естественным продуктом обмена веществ, присутствующих в организме, не могут быть выявлены в крови или моче. В связи с этим интерес представляет изучение свойств отдельных структур на клеточных культурах.

Пептид IPH- AVN содержит низкомолекулярный пептид, обладает ангио – и вазопротекторными свойствами и оказывает нормализующее действие на сосудистую систему.

Экспериментальные исследования показали, что пептид IPH- AVN регулирует процессы метаболизма в сосудах, снижает проницаемость сосудистой стенки, повышает резервные возможности организма, что позволяет предполагать эффективность применения пептида IPH- AVN для нормализации функций сосудистой системы человека при нарушениях различного генеза.

В связи с этим целью нашего исследования было изучение ангиопротекторных и других свойств пептида.

Характеристика эксперимента

Наиболее часто используемый вид лабораторных животных для исследований свойств пептидов, рекомендуемый МЗ РФ в Руководстве по проведению доклинических исследований лекарственных средств [Миронов А.Н., Бунатян Н.Д. и др., 2012], — это крысы, так как процессы фармакокинетики схожи с таковыми у человека.

Для изучения свойств пептида IPH- AVN нами была создана модель мышечной травмы с поражением сосудистого русла. В целях вызова мышечной травмы нами был введен препарат нотексин в четырехглавую мышцу левой конечности крыс, а также применялись аппликации солевых растворов (хлористого железа) для создания дополнительных очагов тромбоза. Нотексин — пептид из 119 аминокислот из яда змеи Notechis scutatus, с молекулярной массой 13574 Да. Растворим в воде и солевых растворах. Обладает сильной миотоксической активностью.

(Первичная структура:

H2NNLVQFSYLIQCANHGKRPTWHYMDYGCYCGAGGSGTPVDELDRCCKIHDDCYDEAGKKGCFPKMSAYDYYCGENGPYCRNIKKKCLRFVCDCDVEAAFCFAKAPYNNANWNIDTKKRCQ-COOH).

Нами было исследовано 50 крыс в возрасте 14,3±1,1 месяца и весом 409,3±8,3 г,  которым были созданы условия мышечной травмы  с поражением сосудистого русла.

Световой день составлял 12 часов. Для питания животных использовались полноценные корма для грызунов с дополнительным прикормом в виде фруктов и овощей. Вода употреблялась животными самостоятельно из поилок. Пища и жидкость принимались животными ad libitum. Текущая уборка клеток осуществлялась ежедневно. Генеральная уборка с дезинфекцией клеток выполнялась еженедельно. Все процедуры содержания животных, проведения манипуляций и тестирования полученных данных проводились в соответствии со стандартами ISO 10993-1-2003 и ГОСТ РИСО 10993.2-2006.

Крысы были разделены на 2 группы – контрольную (n=25) и основную (n=25). Крысам основной группы перорально через пипетку-дозатор, позволяющую контролировать объём и факт потребления жидкости, вводился раствор, состоящий из воды для инъекций в дозировке 1 мл, в которой растворен лиофилизированный порошок пептидов IPH- AVN в концентрации 0,58 микрограммов (мкг) в расчете на массу тела крысы в сутки (минимальная дозировка, при которой отмечаются признаки улучшения показателей по многолетнему опыту применения пептидов), на протяжении 14 дней. Препарат вводился per os прямо в ротовую полость под наблюдением и отслеживанием его проглатывания.

Спустя 14 суток крыс умертвляли, затем удаляли четырехглавую мышцу левой конечности, фиксировали   с   помощью   погружения   в   раствор 4% параформальдегида в фосфатном буфере (PBS рН = 7,3) в течение 24 часов при температуре 4оС.  Изготавливали срезы толщиной 20 мкм с помощью криотома фирмы Leica модели CM 1510S (Германия). Затем срезы монтировались на предметном стекле и окрашивали гематоксилином  и  эозином.

Для исследования нами применялся микроскоп Olympus IX81. Микроскоп был снабжен цифровой камерой Olympus DP72 (Япония), соединенной с персональным компьютером. Фото- и видеофиксация технологических процессов (процессов эксперимента) с животными не проводилась в соответствии с принципами биомедицинской этики и в связи с отсутствием разрешения этического комитета.

Статистическая обработка

Для оценки достоверности различия результатов, полученных в группах до применения лекарственных препаратов, по сравнению с группами после применения лекарственных препаратов использовали критерий Даннета. Если данные подчинялись нормальному распределению, различия в средних определялись с помощью критерия Стъюдента (t).

Результаты исследования

В срезах четырехглавой мышцы крыс контрольной группы были выявлены очаги ишемии в объеме 75,3±1,2% распространения от всех площади и очаги тромбозов в объеме 66,7±1,2% распространения от всех площади. В то время как у крыс основной группы были выявлены очаги ишемии в 2,3 раза достоверно меньше, чем у крыс контрольной группы, что составило 33,2±0,9% распространения от всех площади и достоверно меньше в 1,8 раз очагов тромбозов в объеме 36,2±1,2% распространения от всех площади, p<0,05 по сравнению с контрольной группой. Этот факт доказывает, что применение пептида IPH- AVN способствует репарации сосудистого русла после повреждения, снижению тромбообразования на основе данных экспериментальной модели.

При изучении капиллярного русла нами было обнаружено, что отмечались участки некротизированных эндотелиоцитов, накопление амилоидных бляшек у крыс контрольной группы. Все эти морфологические показатели свидетельствуют о резком снижении репаративных возможностей внутри клеток. В 1,6 раз в меньшей степени были обнаружены участки некротизированных эндотелиоцитов, накопление амилоидных бляшек у крыс основной группы. Эти данные подтверждают, что применение пептида IPH- AVN способствует ангиогенезу при повреждении сосудистого русла.

Для оценки нормализующего действия пептида IPH- AVN нами была изучена площадь сечения артериального русла (Рисунок 1).

Таким образом, нами было обнаружено, что у крыс, получавших пептид IPH- AVN площадь сечения артериального русла в 1,8 раз меньше, чем у крыс контрольной группы. Учитывая резкое снижение репаративных возможностей эпителиоцитов, можно сделать вывод, что такое снижение площади артериального русла свидетельствует о более низкой необходимости компенсаторных реакций, которые проявляются увеличением площади сечения сосудов артериального русла при повреждении и подтверждают высокую репаративную активность пептида IPH- AVN в отношении способности восстанавливать повреждение сосудистой стенки.

Соответственно, пептид  IPH- AVN обладает ангиопротекторным действием и повышает адаптационную способность эндотелиоцитов у крыс с повреждением сосудистого русла по экспериментальным данным.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, применение пептида IPH- AVN способствует репарации сосудистого русла после повреждения, снижению тромбообразования на основе данных экспериментальной модели.

Применение пептида IPH- AVN способствует ангиогенезу при повреждении сосудистого русла. Пептид IPH- AVN имеет высокую репаративную активность в отношении способности восстанавливать повреждение сосудистой стенки. Пептид  IPH- AVN обладает ангиопротекторным действием и повышает адаптационную способность эндотелиоцитов у крыс с повреждением сосудистого русла по экспериментальным данным.

Литература

  1. Васильев И.А., Ступак В.В., Черных В.А., Зайдман А.М., Половников Е.В., Черных Е.Р., Шевела Е.Я., Дергилев А.П. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ МОДЕЛИ СОСУДИСТЫХ ПОРАЖЕНИЙ ГОЛОВНОГО МОЗГА (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ) // Успехи современного естествознания. – 2015. – № 1-3. – С. 366-369
  2. Линькова Н.С., Дробинцева А.О., Орлова О.А., Кузнецова Е.П., Полякова В.О., Кветной И.М., Хвинсон В.Х. Пептидная регуляция функций фибробластов кожи при их старении in vitro // Клеточные технологии в биологии и медицине. – 2016. — №1. – С. 40-44.
  3. Хавинсон В.Х. Пептидная регуляция старения. СПб.: Наука, 2009. — 50 с.
  4. Orekhov A.N., Andreeva E.R., Bobryshev Y.V. Cellular mechanisms of human atherosclerosis: Role of cell-to-cell communications in subendothelial cell functions // Tissue Cell. — 2016. — V. 48. — N 1. — P. 25-34.