Исследование свойств пептида IPH LGA

В настоящее время большой интерес представляет изучение свойств пептидов. Пептиды имеют ту же структуру, что и белки (протеины), но размер этих молекул меньше. Важно также отметить, что короткие пептиды, являясь естественным продуктом обмена веществ, присутствующих в организме, не могут быть выявлены в крови или моче. В связи с этим интерес представляет изучение свойств отдельных структур на клеточных культурах.
Пептид IPH LGA представляет собой пептидный комплекс, содержащий определённую последовательность аминокислот, обладающий регулирующим действием на органы репродуктивной системы и оказывающий регулирующее действие на функциональную активность семенников.

Результаты экспериментальных исследований показали, что пептид IPH LGA обладает избирательным тканеспецифическим действием на клетки семенников, улучшает их трофику и оказывает регулирующее действие на обменные процессы в них, способствует нормализации функциональных и морфологических изменений в семенниках, снижая риск возникновения различных патологических процессов.

Целью нашего исследования было изучить онкопротекторное свойство пептида на культуре клетки и на основе этих данных предположить эффективность применения пептида IPH LGA для восстановления функции половой системы у мужчин.

1 этап.

Для оценки цитостатических и онкопротекторных свойств пептида IPH LGA в отношении моче-половой системы нами были выбраны эмбриональные стволовые клетки (ЭСК), которые относятся к плюрипотентному типу, это значит, что они могут дифференцироваться во все три первичных зародышевых листка: эктодерму, энтодерму и мезодерму, из которых в дальнейшем образуются органы и железы моче-половой и других систем. Эмбрион человека достигает стадии бластоцисты, из которой получают стволовые клетки, спустя 5-6 дней после оплодотворения.

Ген LHRH кодирует аминокислотные последовательности для гонадолиберина и пролактиностатина.

Гонадотропин-рилизинг-гормон, или гонадорелин, гонадолиберин, гонадотропин-рилизинг-фактор, сокращённо ГнРГ — один из представителей класса рилизинг-гормонов гипоталамуса. Вырабатывается в гипоталамусе.

ГнРГ стимулирует переднюю долю гипофиза, клетки-гонадотропы, в мембранах которых находятся ГнРГ-рецепторы, к секреции двух гормонов: фолликулостимулирующий гормон (ФСГ) и лютеинизирующий гормон (ЛГ). Эти гормоны также объединяют под общим названием гонадотропинов. Гонадотропин — это гормон, стимулирующий активность гонад, в данном случае семенников. ФСГ стимулирует сперматогенез, вследствие чего клетки Сертоли способствуют завершению развития из сперматид спермиев. ЛГ побуждает клетки Лейдига (интерстициальные клетки семенника) синтезировать гормон тестостерон. Тестостерон стимулирует интерстициальные клетки мужчины. Он вызывает рост и развитие спермиев из клеток зачаткового эпителия, также вместе с ФСГ он оказывает стимулирующее действие на клетки Сертоли.

В связи с этими данными нами было принято решение оценить экспрессию гена LHRH, ответственного за синтез основных мужских гормонов и сперматогенез, чтобы выявить свойство пептида IPH LGA в отношении половой функции у мужчин и способности нормализации гормонального фона.

2 этап.

Вторым этапом нашего экспериментального исследования была оценка маркерных биологических активных молекул иммунофлуоресцентным методом с использованием первичных антител к SSEA-4 (1:150, Abcam) и белку p53 (1:50, Abcam).

Нами были выбраны следующие маркерные биологически активные молекулы:
1) Этап-специфический эмбриональный антиген-4 (SSEA-4), экспрессирующийся на стволовых клетках, является гликосфинголипидом, который чрезмерно экспрессируется при некоторых видах рака и связан с прогрессированием заболевания.
Последние исследования показывают чрезмерную экспрессию этих антигенов при злокачественных новообразованиях предстательной железы. Кроме того, повышение экспрессии SSEA-4 на поверхности клеток связано с потерей клеточно-клеточных взаимодействий и увеличением миграционного фенотипа, что свидетельствует о важной роли SSEA-4 в инвазии рака.

В связи с этими данными нами была поставлена цель изучить влияние пептидного регулятора биологических процессов IPH LGA на супрессию SSEA-4. Для этого эксперимента нами были выбраны клетки линии SC5, способные экспрессировать SSEA-4.

2) Старение полипотентных клеток в культуре связано с увеличением активности гена p53. У мышей, имеющих мутацию в гене p53, отмечена повышенная устойчивость к развитию новообразований в сочетании с сокращением средней продолжительности жизни. Белок p53 играет ключевую роль в эндогенных противоопухолевых механизмах. Белок p53 осуществляет контроль над течением процессов клеточного цикла, а также за отсутствием в геноме повреждений, которые могли бы привести к дальнейшему развитию патологии. Белок р53 является транскрипционным фактором, выполняющим функцию супрессора образования злокачественных опухолей путем активации апоптоза в тканях организма. Белок р53 активируется при повреждениях ДНК, а также при стимулах, которые могут привести к подобным повреждениям или являются сигналом о старении клетки и нарушении ее функциональной активности. Р53-зависимый апоптоз позволяет избежать накопления мутаций, а, в случае, когда они уже возникли, p53-зависимый апоптоз позволяет элиминировать такие потенциально опасные для организма клетки.

Для изучения свойств пептида IPH LGA нами были использованы следующие клеточные культуры Российской коллекции клеточных культур позвоночных (РККК П):
SC5

Происхождение: человек, эмбриональные стволовые клетки (ЭСК), бластоциста (5-6 день развития), полученные в результате ЭКО
Science. 1998. 282: 1145 – 1147; Онтогенез. 2011. 42 (4): 249 – 263;
Цитология. 2012. 54 (1): 5 – 16.

Морфология: колонии округлых клеток с высоким ядерно/цитопламатическим отношением.
Способ культивирования: монослойный; колонии прикреплены к митотически инактивированному (митомицин-С) фидерному слою мезенхимных клеток костного мозга эмбриона человека.

Условия культивирования: среда — Knockout Dulbecco’s modified Eagles medium сыворотка — Knockout Serum Replacement 20% др. компоненты – NEAA 1%, L-глютамин 2mM, 2- меркаптоэтанол 0.1 mM, bFGF — 8 нг/мл
процедура пересева – механический пересев культуры ЭСК проводили под контролем микроскопа путем разделения колонии на фрагменты с помощью одноразового скальпеля и переноса их на новый слой фидера; ежедневная смена среды, пересев каждые 5-6 дней.

криоконсервация — ростовая среда, 10% DMSO, 5х105 клеток/мл в ампуле.

Жизнеспособность после криоконсервации: 60 % (окраска трипановым синим на нулевом пассаже)

Контроль контаминации: бактерии, грибы и микоплазма не обнаружены.
Контроль видовой идентичности: кариологический анализ.
Кариология: 2n= 46, модальное число хромосом 46 (98.0+0.9 %), нормальный кариотип человека (46, XХ), количество полиплоидов (0.2 + 0.2%).
ДНК профиль (STR): Amelogenin: X, X
CSF1PO: 12, 13
D13S317: 8, 11
D16S539: 9, 12
D5S818: 9, 11
D7S820: 8,10,12
THO1: 6, 9.3
TPOX: 10, 11
vWA: 17,17
Другие характеристики:

Среднее время одного удвоения клеточной популяции 28.2 ч.
Линия иммортализованная, прошла более 120 удвоение клеточной популяции.
Экспрессия поверхностных антигенов, характерных для ЭСК человека: SSEA-4, TRA-1-60 и транскрипционных факторов Осt-4, Nanog.

Способность к спонтанной дифференцировке в производные 3-х зародышевых листков.
Способность к образованию in vivo тератом, содержащих производные 3-х зародышевых листков.
Область применения: клеточная биология, эмбриология.

Коллекции: Институт цитологии Российской академии наук (Рисунок 1)

Рисунок 1. Культура эмбриональные стволовые клетки SC 5. Световая микроскопия, х400.

Группы для исследования:
1 группа – измерение экспрессии молекул до начала исследования,
2 группа — контроль (добавление питательной среды, инкубирование сывороточным альбумином),
3 группа – добавление контрольного пептида дипептида Glu-Trp в концентрации 100 микрограммов (мкг);

4 группа – добавление пептида IPH LGA в концентрации 100 микрограммов (мкг).
Для исследования использовали пептиды IPH LGA и Glu-Trp в форме лиофилизированного порошка, которые растворяли стерильной водой для инъекций в объёме 10 мл до конечной концентрации пептидов 100 мкг.

Для большинства диссоциированных клеточных культур, как было показано ранее, наиболее эффективной является концентрация пептидов 100 мкг/мл по многолетнему опыту применения пептидов.

В качестве контроля выбран иммунопротекторный пептид Glu-Trp с известными и хорошо описанными в литературе свойствами [Морозов В.Г., Хавинсон В.Х., Малинин В.В., 2000, Хавинсон В.Х., Морозов В.Г., 2001, Хавинсон В.Х., Кузник Б.И., Линькова Н.С., Проняева В.Е., 2013].
Для измерения уровня экспрессии генов применяли PCR-метод с использованием собственных праймеров и реагентов фирмы Novocasta и наборы моноклональных антител производства фирмы Biosource (Бельгия).
Мазки клеток обрабатывались соответствующими первичными антителами по стандартному протоколу:
1. Трехкратная промывка фосфатно-солевым буфером — ФСБ(рН=7,2) по 5 мин;
2. Пермеабилизация клеток 0,1% Triton X-100, растворенном в ФСБ, в течение 15 мин;
3. Промывка в трех сменах ФСБ (по 5 мин);
4. Инкубация в 1% бычьем сывороточном альбумине (разведенным ФСБ, pH 7,5) в течение 30 мин для блокировки неспецифического связывания;
5. Инкубация с первичными антителами, 60 мин;
6. Промывка в трех сменах ФБС (по 5 мин);
7. Инкубация со вторичными антителами, конъюгированными с флуорохромом Alexa Fluor 488 (1:1000, Abcam) 30 мин при комнатной температуре в темноте;
8. Промывка в трех сменах ФСБ по 5мин;
9. Докраска ядер клеток красителем Hoechst 33258 (Sigma, США) (1:100 от стокового раствора в dH2O) в течение 1 мин (краситель используется в качестве флуоресцентного маркера ДНК, при связывании с которой его флуоресценция усиливается).
10. Промывка в ФСБ 5 мин;
11. Заключение готовых препаратов под покровные стекла в монтирующую среду Dako Fluorescent Mounting Medium (Dako).

Изучение препаратов проводили в конфокальном микроскопе Olympus FluoView FV1000 при увеличении 200, 400, 600. Синим цветом флуоресцирует экспрессия исследуемого маркера. Проводили измерение относительной площади экспрессии в %. Относительную площадь экспрессии рассчитывали, как отношение площади, занимаемой иммунопозитивными клетками, к общей площади клеток в поле зрения и выражали в процентах. Динамика экспрессии генов измерена в условных единицах, базовый уровень принят за 10.

Статистическая обработка экспериментальных данных включала в себя подсчет среднего арифметического, стандартного отклонения и доверительного интервала для каждой выборки и проводилась в программе Statistica 11.0. Если данные подчинялись нормальному распределению, различия в средних определялись с помощью критерия Стюдента (t).

Так, на рисунке 2 нами показано, что пептид IPH LGA достоверно увеличивает в 6,8 раз экспрессию гена LHRH, отвечающего за нормальное образование факторов, формирующих мужскую гормональную систему и сперматогенез.
Рисунок 2. Экспрессия гена LHRH.

*p<0,05 по сравнению с исходными данными;
**p<0,05 по сравнению с контролем;
***p<0,05 между показателями уровня экспрессии при применении Glu-Trp и IPH LGA.

Влияние пептида IPH LGA на экспрессию SSEA-4 в культурах клетки человека
На рисунке 3 показано, что применение пептида IPH LGA снижает экспрессию SSEA-4 в 5,6 раз от исходного уровня, который выявляется в большом количестве при раке предстательной железы и других новообразованиях в организме человека.

Рисунок 3. Влияние пептида IPH LGA на экспрессию SSEA-4 в культуре клеток человека.

*p<0,05 по сравнению с исходными данными;
**p<0,05 по сравнению с контролем;
***p<0,05 между показателями уровня экспрессии при применении Glu-Trp и IPH LGA.

Таким образом, применение пептида IPH LGA носит выраженный онкопротекторный характер, в частности, при злокачественных новообразованиях моче-половой системы по данным уровня экспрессии маркера SSEA-4 на культуре клетки человека.

Влияние пептида IPH LGA на экспрессию белка р53 в культурах клетки человека

На рисунке 4 показано, что применение пептида IPH LGA увеличивает выработку белка р53, который является транскрипционным фактором, выполняющим функцию супрессора образования злокачественных опухолей путем активации апоптоза в тканях организма, что позволяет сделать вывод о противоопухолевых свойствах изучаемого пептида.
Рисунок 4. Влияние пептида IPH LGA на экспрессию белка p53 в культуре клеток человека.

*p<0,05 по сравнению с исходными данными;
**p<0,05 по сравнению с контролем;
***p<0,05 между показателями уровня экспрессии при применении Glu-Trp и IPH LGA.

Р53-зависимый апоптоз также позволяет избежать накопления мутаций, а, в случае, когда они уже возникли, p53-зависимый апоптоз позволяет элиминировать такие потенциально опасные для организма клетки, что позволяет сделать вывод о цитопротекторном действии изучаемого пептида.
Полученные данные свидетельствуют о высокой онкопротекторной активности пептида IPH LGA в отношении клеток репродуктивной системы мужчин по данным экспрессии биологических молекул на культуре клетки.

Выполненные исследования подтверждают высокую биологическую активность пептида IPH LGA в отношении контроля нормального формирования гормонального фона, регулирующего действия на функциональную активность семенников и сперматогенез у человека на генетическом уровне по данным экспрессии генов на культуре клетки.
Полученные данные свидетельствуют о высокой онкопротекторной активности пептида IPH LGA в отношении клеток репродуктивной системы мужчин по данным экспрессии биологических молекул на культуре клетки.