Биологические и клинические простат-протекторные эффекты пептида IPH PRO

Пептид IPH PRO содержит комплекс низкомолекулярных пептидов и обладает нормализующим действием на функцию предстательной железы.

Экспериментальные исследования показали, что пептид IPH PRO регулирует процессы метаболизма в клетках предстательной железы, повышают их резервные возможности, что позволяет предполагать эффективность применения пептида IPH PRO для нормализации функций предстательной железы у мужчин разного возраста при нарушениях различного генеза.

Заболевания предстательной железы в настоящее время занимают существенное место среди урологической патологии, имеют тенденцию к увеличению заболеваемости и приобретают все возрастающую социальную значимость. По мнению ряда авторов, более 70% мужчин в возрасте старше 50 лет страдают заболеваниями предстательной железы, в том числе доброкачественной гиперплазией простаты и онкологическими заболеваниями. Таким образом, поиск новых эффективных и безопасных средств для профилактики и лечения заболеваний предстательной железы является актуальной задачей.

Не меньшую опасность для социальной жизни мужчин представляет и развитие хронического простатита. Хроническим простатитом страдает более 50% мужского населения. Хронический простатит чаще поражает мужчин в возрасте от 20 до 40 лет, находящихся в периоде наибольшей сексуальной, репродуктивной и трудовой активности, что повторно доказывает не только медицинский, но и социально значимый аспект коррекции данного состояния, а значит, и поиск новых средств лечебно-профилактических мероприятий.

Цель исследования:

Выявить биологические и клинические простат-протекторные эффекты пептида IPH PRO.

Материал и методы.
Для выявления биологических и клинических эффектов изучаемого пептида нами были проведены 3 направления исследований:
1. Исследование эффектов пептида на клетке.
2. Исследование эффектов пептида в эксперименте.
3. Клинические исследования.

В исследовании на клетке для оценки цитостатических и онкопротекторных свойств пептида IPH PRO в отношении мочеполовой системы нами были выбраны эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) (SC5, происхождение: человек, эмбриональные стволовые клетки (ЭСК), бластоциста (5-6 день развития), полученные в результате ЭКО, которые относятся к плюрипотентному типу. Далее нами проведена экспрессия основных генов, участвующих в образовании органов и желез моче-половой системы: генов, участвующих в дифференцировке гонад и онтогенезе половых органов, и генов, ответственных за синтез половых белков –гормонов и рецепторов к этим гормонам. Также нами была проведена оценка маркерных биологических активных молекул иммунофлуоресцентным методом с использованием первичных антител к SSEA-4 (1:150, Abcam) и белку p53 (1:50, Abcam). Нами были созданы следующие группы для исследования:
1 группа – измерение экспрессии молекул до начала исследования;
2 группа — контроль (добавление питательной среды, инкубирование сывороточным альбумином);
3 группа – добавление контрольного пептида дипептида Glu-Trp в концентрации 100 микрограммов (мкг);
4 группа – добавление пептида IPH PRO в концентрации 100 микрограммов (мкг).

В качестве контроля выбран иммунопротекторный пептид Glu-Trp с известными и хорошо описанными в литературе свойствами. Для измерения уровня экспрессии генов применяли PCR-метод с использованием собственных праймеров и реагентов фирмы Novocasta и наборы моноклональных антител производства фирмы Biosource (Бельгия). Изучение препаратов проводили в конфокальном микроскопе Olympus FluoView FV1000 при увеличении 200, 400, 600. Синим цветом флуоресцирует экспрессия исследуемого маркера. Проводили измерение относительной площади экспрессии в %. Статистически обработка данных проводилась по стандартным методикам медико-биологического исследования с применением t-критерия Стьюдента для определения достоверности данных.

Для эксперимента нами был выбран наиболее часто используемый вид лабораторных животных для исследований свойств пептидов, рекомендуемый МЗ РФ в Руководстве по проведению доклинических исследований лекарственных средств, — это крысы. Для изучения свойств пептида IPH PRO нами была создана модель гипокинетического стресса, при которой у экспериментальных крыс развился простатит. Было исследовано 40 крыс в возрасте 14,2±1,2 месяца и весом 409,6±9,5 г, которым были созданы условия гипокинетического стресса для развития простатита продолжительностью 12 суток путём помещения в специальные плексигласовые клетки — пеналы с размерами ячеек: 140×60×60 мм для каждой крысы, где самцы ежедневно находились в состоянии иммобилизации. Все процедуры содержания животных, проведения манипуляций и тестирования полученных данных проводились в соответствии со стандартами ISO 10993-1-2003 и ГОСТ РИСО 10993.2-2006. Крысы были разделены на 2 группы – контрольную (n=20) и основную (n=20).
Крысам основной группы перорально через пипетку-дозатор, позволяющую контролировать объём и факт потребления жидкости, вводился рас-твор, состоящий из воды для инъекций в дозировке 1 мл, в которой растворен лиофилизированный порошок пептидов IPH PRO в концентрации 0,59 микрограммов (мкг) в расчете на массу тела крысы в сутки (минимальная дозировка, при которой отмечаются признаки улучшения показателей по многолетнему опыту применения пептидов), на протяжении 14 дней. Спустя 26 суток крыс умертвляли, затем удаляли предстательную железу, фиксировали с помощью погружения в раствор 4% параформальдегида в фосфатном буфере (PBS рН = 7,3) в течение 24 часов при температуре 4оС. Изготавливали срезы толщиной 20 мкм с помощью криотома фирмы Leica модели CM 1510S (Германия). Затем срезы монтировались на предметном стекле и окрашивали гематоксилином и эозином. Для исследования нами применялся микроскоп Olympus IX81. Для оценки достоверности различия результатов, полученных в группах до применения лекарственных препаратов, по сравнению с группами после применения лекарственных препаратов использовали критерий Даннета.

Клинические испытания пептида IPH PRO проведены у 57 больных хроническим простатитом и доброкачественной гиперплазией предстательной железы. Для оценки эффективности дозы 100 мкг (n=57 человек) для изучаемых пептидов нами были проведены исследования по изучению эффективности применения пептидов в дозировке 50 мкг (n= 55 человек) и 150 мкг (n=56 человек). Всем пациентам были выставлены диагнозы и проводилось соответствующее лечение в соответствии с Российскими клиническими рекомендациями по урологии от 2013 года.
Пептид IPH PRO применялся перорально по следующей схеме: по 1 капсуле (100 мкг пептида) 1 раз в день в течение 30 дней, затем 30 дней перерыв — и повторение аналогичного курса в течение еще 30 дней, снова перерыв 30 дней — и третий курс в течение 30 дней. Общий курс составил 6 месяцев (в нем 3 курса по 30 дней и 3 перерыва по 30 дней).

Оценка эффективности усовершенствованной схемы ведения таких пациентов с применением пептида IPH PRO проводилась через 3 и 6 месяцев. За контрольные значения были выбраны исходные данные, полученные до начала исследования. Эффективность применения пептида IPH PRO оценивали на основании динамики жалоб больных, степени брюшного давления при мочеиспускании и характера струи мочи, флуорометрического индекса и оценки качества жизни. В основе статистических методов обработки данных был проведен расчет средних абсолютных и относительных величин с расчетом ошибки средней; выполнена оценка значимости различий двух совокупностей с применением критерия t Стьюдента.

Биологические простат-протекторные эффекты пептида IPH PRO на культуре клетки

Влияние пептида IPH PRO на экспрессию генов, ответственных за репродуктивную систему человека, показано на рисунке 1 и 2. Установлено, что пептид IPH PRO достоверно увеличивает экспрессию генов, отвечающих за нормальное образование как мужских половых органов, так и факторов, формирующих гормональную систему.

Рисунок 1. Суммарная экспрессия генов, участвующих в дифференцировке гонад и онтогенезе мужских половых органов: SRY, SOX9, WT1, гена, кодирующий стероидогенный фактор SF1.

*p<0,05 по сравнению с исходными данными;
**p<0,05 по сравнению с контролем;
***p<0,05 между показателями уровня экспрессии при применении Glu-Trp и IPH PRO.

Рисунок 2. Суммарная экспрессия генов, ответственных за синтез половых белков –гормонов и рецепторов к этим гормонам: гормоны и рецепторы к гормонам: FSH (ген фолликулостимулирующего гормона), LH (ген лютеинизирующего гормона), АМН (ген антимюллерова гормона), AMHR (ген рецептора AMHR), TAR (ген андрогенного рецептора), GnRH (ген гонадотропин-рилизинг-гормона), GnRH-R (ген рецептора GnRH), LH-R (ген рецептора LH- лютеинизирующего гормона), FSH-R (ген рецептора FSH — фолликулостимулирующего гормона).

*p<0,05 по сравнению с исходными данными;
**p<0,05 по сравнению с контролем;
***p<0,05 между показателями уровня экспрессии при применении Glu-Trp и IPH PRO.

Из приведенных данных видно, что под воздействием пептида IPH PRO в культуре клеток человека происходит статистически достоверное увеличение экспрессии генов, ответственных за онтогенез мужских половых органов и гормонального фона. Эти данные показывают, что пептид IPH PRO достоверно увеличивает в культуре клеток человека «каскад» сигнальных молекул, который необходим для активации процессов пролиферации и дифференцировки стволовых клеток в клетки мужских половых органов, в частности, клетки предстательной железы.

Влияние пептида IPH PRO на экспрессию SSEA-4 в культурах клетки человека представлено на рисунке 3. Установлено, что применение пептида IPH PRO снижает экспрессию SSEA-4 в 4 раза от исходного уровня, который выявляется в большом количестве при раке предстательной железы и других новообразованиях в организме человека.

Рисунок 3. Влияние пептида IPH PRO на экспрессию SSEA-4 в культуре клеток человека.

*p<0,05 по сравнению с исходными данными;
**p<0,05 по сравнению с контролем;
***p<0,05 между показателями уровня экспрессии при применении Glu-Trp и IPH PRO.

Следовательно, применение пептида IPH PRO носит выраженный онкопротекторный характер, в частности, при злокачественных новообразованиях предстательной железы по данным уровня экспрессии маркера SSEA-4 на культуре клетки человека.

Влияние пептида IPH PRO на экспрессию белка р53 в культурах клетки человека представлено на рисунке 4. Данные показывают, что применение пептида IPH PRO увеличивает выработку белка р53, который является транскрипционным фактором, выполняющим функцию супрессора образования злокачественных опухолей путем активации апоптоза в тканях организма, что позволяет сделать вывод о противоопухолевых свойствах изучаемого пептида.

Рисунок 4. Влияние пептида IPH PRO на экспрессию белка p53 в культуре клеток человека.

*p<0,05 по сравнению с исходными данными;
**p<0,05 по сравнению с контролем;
***p<0,05 между показателями уровня экспрессии при применении Glu-Trp и IPH PRO.

Р53-зависимый апоптоз также позволяет избежать накопления мутаций, а, в случае, когда они уже возникли, p53-зависимый апоптоз позволяет элиминировать такие потенциально опасные для организма клетки, что позволяет сделать вывод о цитопротекторном действии изучаемого пептида.
Полученные данные свидетельствуют о высокой онкопротекторной активности пептида IPH PRO в отношении клеток репродуктивной системы мужчин по данным экспрессии биологических молекул на культуре клетки.

В ходе эксперимента нами было обнаружено, что в контрольной группе в строме предстательной железы заметны значительные участки лейкоцитарной инфильтрации, что составило площадь распределения 76,8±1,2%. В то время как у крыс, которым вводили пептид IPH PRO, площадь распределения лейкоцитарной инфильтрации составила 41,4±0,4% (Рисунок 5).

Рисунок 5. Инфильтрация лейкоцитами в строме предстательной железы. Окраска гематоксилином и эозином Х 400.

А- без применения пептида IPH PRO.
В- с применением пептида IPH PRO.
Следовательно, пептид IPH PRO снижает степень воспалительного процесса при развитии простатита на экспериментальной модели.

При изучении капиллярного русла нами было обнаружено, что, помимо развившегося утолщения и отёка тканей, отмечались участки некротизированных эндотелиоцитов, накопление амилоидных бляшек. Все эти морфологические показатели свидетельствуют о резком снижении репаративных возможностей внутри клеток.
Для оценки нормализующего действия пептида IPH PRO нами была изучена площадь сечения артериального русла (Рисунок 6).

Рисунок 6. Площадь сечения артериального русла (%).

Соответственно, нами было обнаружено, что у крыс, получавших пептид IPH PRO площадь сечения артериального русла в 1,7 раз меньше, чем у крыс с простатитом без лечения. Учитывая резкое снижение репаративных возможностей эпителиоцитов, можно сделать вывод, что такое снижение площади артериального русла свидетельствует о более низкой необходимости компенсаторных реакций, которые проявляются увеличением площади сечения сосудов артериального русла при стрессе.
Можно сделать вывод, что пептид IPH PRO обладает цитостатических действием и повышает адаптационную способность клеток у крыс с простатитом по экспериментальным данным.

Результаты клинического изучения применения пептида IPH PRO показали, что поллакиурия (учащение мочеиспускания) полностью перестала беспокоить 73,2% больных хроническим простатитом, у 88,1% пациентов исчезла потребность ночного мочеиспускания. Странгурия (затрудненное мочеиспускание) перестала беспокоить 67,1% больных, 21,5% пациентов отметили заметное усиление струи мочи и облегчение акта мочеиспускания (Таблица 1).

Таблица 1.

*p<0,05 между показателями по сравнению с контрольной группой (до начала исследования).
**p<0,05 между показателями через 3 месяца и 6 месяцев.
# p<0,05 между показателями при применении 50 мкг и 100 мкг.

Следует отметить, что максимально положительные достоверные результаты были обнаружены в отношении времени достижения максимальной скорости мочеиспускания, которое через 6 месяцев исследования снизилось до 5,3 ± 0,1 секунд, что соответствует норме.

Динамика результатов исследования у пациентов с доброкачественной гиперплазией предстательной железы через 3 и 6 месяцев применения пептида IPH PRO отображена в таблице 2.

Таблица 2.

*p<0,05 между показателями по сравнению с контрольной группой (до начала исследования).
** p<0,05 между показателями через 6 месяцев и 3 месяца.
# p<0,05 между показателями при применении 50 мкг и 100 мкг.

Обращает на себя внимание факт достоверного снижения количества мочеиспусканий в дневное время после применения пептида IPH PRO в 1,5 раза через 3 месяца и в 1,8 раза через 6 месяцев по сравнению с исходным уровнем, p<0,05 между показателями по сравнению с контрольной группой (до начала исследования), p<0,05 между показателями через 6 месяцев и 3 месяца, что, вероятно, также повлияло на качество жизни пациентов с доброкачественной гиперплазией предстательной железы.
Нами не обнаружено достоверных отличий между показателями при применении 100 мкг и 150 мкг по всем исследуемым параметрам, что доказывает факт, что при повышении оптимальной дозировки применяемого пептида эффективность не повышается как через 3 месяца, так и через 6 месяцев. Также нами не обнаружено достоверных отличий между показателями при применении 50 мкг и до начала исследования по всем исследуемым параметрам, что доказывает факт, что эффективная оптимальная дозировка для пептида 100 мкг.

Следует отметить, что урофлоуграммы, записанные после лечения у пациентов с доброкачественной гиперплазией предстательной железы I и II стадии, показали восстановление основных параметров мочеиспускания до нормальных значений. При III стадии болезни этому препятствовало снижение эластичности шейки мочевого пузыря из-за склеротических изменений ткани предстательной железы, но, тем не менее, у таких больных наблюдалось заметное усиление струи мочи.
Состояние пациентов с доброкачественной гиперплазией предстательной железы после пептида IPH PRO характеризовалось улучшением субъективных и объективных показателей уродинамики. Для подтверждения данного факта, мы провели оценку качества жизни с помощью опросника EuroQol EQ-5D (таблица 3).

Таблица 3.

Так, качество жизни пациентов улучшилось по каждому параметру, максимально в плане ощущения боли и развития тревожно-депрессивного состояния. Следует отметить, что эти параметры возросли в 2 раза. Субъективная оценка качества жизни по визуально-аналоговой шкале возросла в 1,8 раз по сравнению с исходными данными после 3х месячного применения пептида IPH PRO и сохранялась положительной на протяжении всего исследования.

Выполненные исследования подтверждают высокую биологическую активность пептида IPH PRO в отношении контроля нормального формирования репродуктивной системы у человека на генетическом уровне по данным экспрессии генов, ответственных за формирование мужских половых органов и гормонов, на культуре клетки. Полученные данные свидетельствуют о высокой онкопротекторной активности пептида IPH PRO в отношении клеток предстательной железы по данным экспрессии биологических молекул на культуре клетки.

Также было доказано, что пептид IPH PRO оказывает регулирующее воздействие на функциональную активность клеток мужских половых органов, что проявляется цитостатическим и противовоспалительным действием в отношении клеток предстательной железы по данным экспериментальных исследований.

С клинической точки зрения нами было получено, что применение пептида IPH PRO оказывает регулирующее воздействие на функциональную активность клеток предстательной железы, способствует нормализации функции мочеиспускания, снижает количество дневных мочеиспусканий и приводит к субъективному повышению качества жизни.

Применение пептида IPH PRO рекомендовано в виде биологически активной добавки к пище с лечебно-профилактической целью для пациентов с хроническим простатитом и доброкачественной гиперплазией предстательной железы в оптимальной эффективной дозировке 100 мкг как средства для нормализации функций предстательной железы.