Отчет о научно-исследовательской работе «Исследование свойств пептида IPH-AEN в клеточных культурах человека»

1 этап.

Для оценки цитостатических и онкопротекторных свойств пептида IPH-AEN в отношении костно- хрящевой системы нами были выбраны эмбриональные стволовые клетки (ЭСК), которые относятся к плюрипотентному типу, это значит, что они могут дифференцироваться во все три первичных зародышевых листка: эктодерму, энтодерму и мезодерму, из которых в дальнейшем образуются ткани хрящевой системы. Эмбрион человека достигает стадии бластоцисты, из которой получают стволовые клетки, спустя 5-6 дней после оплодотворения.

Гены, ответственные за формирование костно- хрящевой ткани,- ген COMP (Транскрипт: NM_000095) и ген  COL2A1.

Мутации в гене хрящевого тромбоспондина (COMP) вызывают ахондроплазию и псевдоэпифизарную дисплазию, сопровождающиеся поражением крупных суставов. В связи с этими данными нами было принято решение изучить активность данного гена при применении пептида IPH-AEN.

Мутации гена и изменения экспрессии гена COL2A1 связаны с тяжестью дегенеративных поражений костно- хрящевой ткани. Ген COL1А1 кодирует белок альфа-1 цепи коллагена I типа и является потенциально значимым в формировании генетической предрасположенности к остеопорозу и хрупкости костей с риском переломов. В связи с этими данными нами было принято решение изучить активность данного гена при применении пептида IPH-AEN.

Нами была произведена оценка экспрессия генов, отвечающих за онтогенез костно- хрящевой ткани.

2 этап.

Вторым этапом нашего экспериментального исследования была оценка маркерных биологических активных молекул иммунофлуоресцентным методом с использованием первичных антител к ММР13 (1:120, Abcam) и белку p53 (1:50, Abcam).

Нами были выбраны следующие маркерные биологически активные молекулы:

1) Белок ММР13  – маркер ремоделирования межклеточного матрикса и функциональной активности хондроцитов. Матриксные металлопротеиназы (ММР), относящиеся к семейству цинковых металлопротеиназ, участвуют в обмене белков межклеточного матрикса. Ведущая роль в процессе физиологического ремоделирования гиалинового хряща сустава отведена металлопротеиназам, относящимся к классу коллагеназ (ММР-1, ММР-13 и др.). В норме металлопротеиназы секретируются фибробластами, хондроцитами, эпителиальными клетками, макрофагами в очень малых количествах в неактивном состоянии. Важной особенностью металлопротеиназ является их способность к индукции под действием различных факторов. Регуляция активности коллагеназ осуществляется цитокинами, факторами роста, различными химическими соединениями (липополисахариды бактериального происхождения и др.), факторами, влияющими на мембрану клетки. Активность ММР подавляется тканевыми ингибиторами металлопротеиназ (TIMP), а также гормонами (глюкокортикостероиды и т.п.). Ранее считалось, что главная роль в деструкции матрикса принадлежит ММР-1, затем была установлена и важная роль ММР-13, которая разрушает коллаген II типа, стромелизин и др. Известно, что в механизмах активизации металлопротеиназ значимую роль отводят сигнальным белкам S100A8 и A9. В результате, активируются NF-kB рецепторы синовиальных фибробластов, что определяет высвобождение многих цитокинов, таких как ИЛ-6, ИЛ-10, GM-CSF, IL-8 и хемоаттрактант моноцитов, который, в свою очередь, играет значимую роль в активации металлопротеиназ и обуславливает их высокую активность при остеоартрозе [Демкин С.А. и др., 2017].

2) Старение полипотентных клеток в культуре связано с увеличением активности гена p53. У мышей, имеющих мутацию в гене p53, отмечена повышенная устойчивость к развитию новообразований в сочетании с сокращением средней продолжительности жизни. Белок p53 играет ключевую роль в эндогенных противоопухолевых механизмах [Donekover et al., 2002]. Белок p53 осуществляет контроль над течением процессов клеточного цикла, а также за отсутствием в геноме повреждений, которые могли бы привести к дальнейшему развитию патологии. Белок р53 является транскрипционным фактором, выполняющим функцию супрессора образования злокачественных опухолей путем активации апоптоза в тканях организма. Белок р53 активируется при повреждениях ДНК, а также при стимулах, которые могут привести к подобным повреждениям или являются сигналом о старении клетки и нарушении ее функциональной активности [Arshad H. et al., 2010]. Р53-зависимый апоптоз позволяет избежать накопления мутаций, а, в случае, когда они уже возникли, p53-зависимый апоптоз позволяет элиминировать такие потенциально опасные для организма клетки [Burtis C., Ashwood E., Bruns D., 2006].

Для изучения свойств пептида IPH-AEN нами были использованы следующие клеточные культуры Российской коллекции клеточных культур позвоночных (РККК П):

SC5

Происхождение: человек, эмбриональные стволовые клетки (ЭСК), бластоциста (5-6 день развития), полученные в результате ЭКО

Science. 1998. 282: 1145  – 1147; Онтогенез. 2011. 42 (4): 249 – 263;

Цитология. 2012. 54 (1): 5 – 16.

Морфология: колонии округлых клеток с высоким ядерно/цитопламатическим отношением.

Способ культивирования: монослойный; колонии прикреплены к митотически инактивированному (митомицин-С) фидерному слою мезенхимных клеток костного мозга эмбриона человека.

Условия культивирования: среда  —  Knockout Dulbecco’s modified Eagles medium сыворотка — Knockout Serum Replacement 20% др. компоненты – NEAA 1%, L-глютамин 2mM, 2- меркаптоэтанол 0.1 mM, bFGF — 8 нг/мл

процедура пересева – механический пересев культуры ЭСК проводили под контролем микроскопа путем разделения колонии на фрагменты с помощью одноразового скальпеля и переноса их на новый слой фидера; ежедневная смена среды, пересев каждые 5-6 дней.

криоконсервация — ростовая среда, 10% DMSO, 5х105 клеток/мл в ампуле.

Жизнеспособность после криоконсервации: 60 % (окраска трипановым синим на нулевом пассаже)

Контроль контаминации: бактерии, грибы и микоплазма не обнаружены.

Контроль видовой идентичности: кариологический анализ.

Кариология: 2n= 46, модальное число хромосом 46 (98.0+0.9 %), нормальный кариотип человека (46, XХ), количество полиплоидов (0.2 + 0.2%).

ДНК профиль (STR): Amelogenin:  X, X

CSF1PO:    12, 13

D13S317:   8, 11

D16S539:   9, 12

D5S818:     9, 11

D7S820:     8,10,12

THO1:        6, 9.3

TPOX:        10, 11

vWA:         17,17

Другие характеристики:

Среднее время одного удвоения клеточной популяции 28.2 ч.

Линия иммортализованная, прошла более 120 удвоение клеточной популяции.

Экспрессия поверхностных антигенов, характерных для ЭСК человека: SSEA-4, TRA-1-60 и транскрипционных факторов Осt-4, Nanog.

Способность к спонтанной дифференцировке в производные 3-х зародышевых листков.

Способность к образованию in vivo тератом, содержащих производные 3-х зародышевых листков.

Область применения: клеточная биология, эмбриология.

Коллекции: Институт цитологии Российской академии наук (Рисунок 1) (Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Институт цитологии Российской академии наук, http://www.cytspb.rssi.ru/eotk/infbull_ru.htm, М.С. Богданова, Г.Г. Полянская, А.М. Кольцова «Клеточные культуры» Информационный бюллетень. Вып. 34 (2018),

http://www.cytspb.rssi.ru/rkkk/katalog1n_2017_with_figs.pdf).

Группы для исследования:

1 группа – измерение экспрессии молекул до начала исследования,

2 группа — контроль (добавление питательной среды, инкубирование сывороточным альбумином),

3 группа – добавление контрольного пептида дипептида Glu-Trp в концентрации 100 микрограммов (мкг);

4 группа – добавление пептида IPH-AEN в концентрации 100 микрограммов (мкг).

Для исследования использовали пептиды IPH-AEN и Glu-Trp в форме лиофилизированного порошка, которые растворяли стерильной водой для инъекций в объёме 10 мл до конечной концентрации пептидов 100 мкг.

Для большинства диссоциированных клеточных культур, как было показано ранее, наиболее эффективной является концентрация пептидов 100 мкг/мл по многолетнему опыту  применения пептидов [Линькова Н.С. и др., 2016; Khavinson V. et al., 2017].

В качестве контроля выбран иммунопротекторный пептид Glu-Trp с известными и хорошо описанными в литературе свойствами [Морозов В.Г., Хавинсон В.Х., Малинин В.В., 2000, Хавинсон В.Х., Морозов В.Г., 2001, Хавинсон В.Х., Кузник Б.И., Линькова Н.С., Проняева В.Е., 2013].

Для измерения уровня экспрессии генов применяли PCR-метод с использованием собственных праймеров и реагентов фирмы Novocasta и наборы моноклональных антител производства
фирмы Biosource (Бельгия).

Мазки клеток обрабатывались соответствующими первичными антителами по стандартному протоколу:

1. Трехкратная промывка фосфатно-солевым буфером — ФСБ(рН=7,2) по 5 мин;
2. Пермеабилизация клеток 0,1% Triton X-100, растворенном в ФСБ, в течение 15 мин;
3. Промывка в трех сменах ФСБ (по 5 мин);
4. Инкубация в 1% бычьем сывороточном альбумине (разведенным ФСБ, pH 7,5) в течение 30 мин для блокировки неспецифического связывания;
5. Инкубация с первичными антителами, 60 мин;
6. Промывка в трех сменах ФБС (по 5 мин);
7. Инкубация со вторичными антителами, конъюгированными с флуорохромом Alexa Fluor 488 (1:1000, Abcam) 30 мин при комнатной температуре в темноте;
8. Промывка в трех сменах ФСБ по 5мин;
9. Докраска ядер клеток красителем Hoechst 33258 (Sigma, США) (1:100 от стокового раствора в dH₂O) в течение 1 мин (краситель используется в качестве флуоресцентного маркера ДНК, при связывании с которой его флуоресценция усиливается).
10. Промывка в ФСБ 5 мин;
11. Заключение готовых препаратов под покровные стекла в монтирующую среду Dako Fluorescent Mounting Medium (Dako).

Изучение препаратов проводили в конфокальном микроскопе Olympus FluoView FV1000 при увеличении 200, 400, 600. Синим цветом флуоресцирует экспрессия исследуемого маркера. Проводили измерение относительной площади экспрессии в %. Относительную площадь экспрессии рассчитывали, как отношение площади, занимаемой иммунопозитивными клетками, к общей площади клеток в поле зрения и выражали в процентах. Динамика экспрессии генов измерена в условных единицах, базовый уровень принят за 10.

Статистическая обработка экспериментальных данных включала
в себя подсчет среднего арифметического, стандартного отклонения
и доверительного интервала для каждой выборки и проводилась
в программе Statistica 11.0. Если данные подчинялись нормальному распределению, различия в средних определялись с помощью критерия Стъюдента (t).

Влияние пептида IPH—AEN на экспрессию генов, ответственных за формирование хрящевой и костной ткани

Так, на рисунке 2 нами показано, что пептид IPH-AEN достоверно увеличивает экспрессию гена COMP, отвечающего за нормальное образование и формирование костно — хрящевой ткани, в частности, регулирующего метаболизм (обмена веществ) в костно — хрящевой ткани и обспечивающего протекторное (защитное) действие от поражения суставов у человека, то есть пептид IPH-AEN оказывает противодействие дегенеративным процессам в хрящевой ткани суставов тем самым обеспечивая профилактику заболеваний суставов.

Так, на рисунке 3 нами показано, что пептид IPH-AEN достоверно увеличивает экспрессию гена COL2A1, контролирующего дегенеративные поражения хрящевой ткани, в частности, значимого в формировании генетической предрасположенности к остеопорозу и хрупкости костей с риском переломов.

Таким образом, из приведенных данных видно, что под воздействием пептида IPH-AEN в культуре клеток человека происходит статистически достоверное увеличение экспрессии генов, ответственных за онтогенез костно- хрящевой ткани, а именно за синтез хрящевых клеток, что обеспечивает быструю регенерацию костной ткани, улучшает выработку коллагена и гиалуроновой кислоты. Эти данные показывают, что пептид IPH-AEN достоверно увеличивает в культуре клеток человека «каскад» сигнальных молекул, который необходим для активации процессов пролиферации и дифференцировки стволовых клеток в клетки хрящевой ткани, формирования системы хрящей, регуляции метаболизма в хрящевой ткани и оказании протекторых (защитных) свойств от поражения суставов, контроля дегенеративных поражений хрящевой ткани, остеопороза и хрупкости костей с риском переломов у человека.

Влияние пептида IPH—AEN на экспрессию белка ММР13 в культурах клетки человека

На рисунке 4 показано, что применение пептида IPH-AEN повышает экспрессию ММР13 в 9,6 раз от исходного уровня, который является ключевым фактором ремоделирования межклеточного матрикса и функциональной активности хондроцитов, регулируя тем самым синтез хрящевых клеток и обеспечивая быструю регенерация костной ткани.

Таким образом, применение пептида IPH-AEN носит выраженный хондро- и остеопротекторный характер, в частности, индуцирует дифференцировку полипотентных хондрогенных и остеогенных клеток в направлении нормального формирования хрящевой ткани и ее регенерации. В частности, эти данные свидетельствуют о том, что применение пептида IPH-AEN обеспечивает синтез хрящевых клеток и быструю регенерацию костной ткани, что приводит к поддержанию полноценной функциональности суставов.

Влияние пептида IPH—AEN на экспрессию белка р53 в культурах клетки человека

На рисунке 5 показано, что применение пептида IPH-AEN увеличивает выработку белка р53, который является транскрипционным фактором, выполняющим функцию супрессора образования злокачественных опухолей путем активации апоптоза в тканях организма, что позволяет сделать вывод о противоопухолевых свойствах изучаемого пептида.

Р53-зависимый апоптоз также позволяет избежать накопления мутаций, а, в случае, когда они уже возникли, p53-зависимый апоптоз позволяет элиминировать такие потенциально опасные для организма клетки, что позволяет сделать вывод о цитопротекторном действии изучаемого пептида.

Полученные данные свидетельствуют о высокой онкопротекторной активности пептида IPH-AEN в отношении клеток костно-хрящевой системы по данным экспрессии биологических молекул на культуре клетки.

Выполненные исследования подтверждают высокую биологическую активность пептида IPH-AEN в отношении нормального образования и формирования костно-хрящевой ткани, регуляции метаболизма (обмена веществ) в хрящевой ткани и оказания протекторного (защитного) действия от поражения суставов у человека, а также контроля развития дегенеративных поражений хрящевой ткани, в частности, при остеопорозе и травмах. Пептид IPH-AEN оказывает противодействие дегенеративным процессам в хрящевой ткани суставов, тем самым обеспечивая профилактику заболеваний суставов.

Из полученных данных видно, что под воздействием пептида IPH-AEN в культуре клеток человека происходит статистически достоверное увеличение экспрессии генов, ответственных за онтогенез костно- хрящевой ткани, а именно за синтез хрящевых клеток, что обеспечивает быструю регенерацию костной ткани, улучшает выработку коллагена и гиалуроновой кислоты. Эти данные показывают, что пептид IPH-AEN достоверно увеличивает в культуре клеток человека «каскад» сигнальных молекул, который необходим для активации процессов пролиферации и дифференцировки стволовых клеток в клетки хрящевой ткани, формирования системы хрящей, регуляции метаболизма в хрящевой ткани и оказании протекторых (защитных) свойств от поражения суставов, контроля дегенеративных поражений хрящевой ткани, остеопороза и хрупкости костей с риском переломов у человека.

Применение пептида IPH-AEN носит выраженный хондро- и остеопротекторный характер, в частности, индуцирует дифференцировку полипотентных хондрогенных и остеогенных клеток в направлении нормального формирования хрящевой ткани и ее регенерации. В частности, эти данные свидетельствуют о том, что применение пептида IPH-AEN обеспечивает синтез хрящевых клеток и быструю регенерацию костной ткани, что приводит к поддержанию полноценной функциональности суставов.

Полученные данные свидетельствуют о высокой онкопротекторной активности пептида IPH-AEN в отношении клеток системы хрящей по данным экспрессии биологических молекул на культуре клетки.

1. Забелло Т.В., Мироманов А.М., Мироманова Н.А. Генетические аспекты развития остеоартроза // Фундаментальные исследования. – 2015. – № 1-9. – С. 1970-1976
2. Линькова Н.С., Дробинцева А.О., Орлова О.А., Кузнецова Е.П., Полякова В.О., Кветной И.М., Хвинсон В.Х. Пептидная регуляция функций фибробластов кожи при их старении in vitro // Клеточные технологии в биологии и медицине. – 2016. — №1. – С. 40-44.
3. Мутовин Г.Р.Основы клинической генетики (геномика и протеомика наследственной патологии). Учебное пособие для вузов в 2-х томах. Вып. 3. М.: ГЭОТАР-медиа, 2008.
4. Хавинсон В.Х. Пептидная регуляция старения. СПб.: Наука, 2009. — 50 с.
5. Arshad H., Ahmad Z., Hasan S.H. Gliomas: correlation of histologic grade, Ki67 and p53 expression with patient survival // Asian Pac J Cancer Prev. – 2010. – Vol. 11. – N 6. – P. 1637-1640;
6. Meienberg J, Rohrbach M, Neuenschwander S, Spanaus K, Giunta C, Alonso S, Arnold E, Henggeler C, Regenass S, Patrignani A, Azzarello-Burri S, Steiner B, Nygren AO, Carrel T, Steinmann B, Mátyás G. Hemizygous deletion of COL3A1, COL5A2, and MSTN causes a complex phenotype with aortic dissection: a lesson for and from true haploinsufficiency. Eur J Hum Genet. 2010;18:1315–21.
7. Trzeciak T. MicroRNAs: Important Epigenetic Regulators in Osteoarthritis / T. Trzeciak, M. Czarny-Ratajczak // Curr. Genomics. – 2014. – № 6. – P. 481–484.
8. Tsezou A. Osteoarthritis year in review 2014: genetics and genomics // Osteoarthritis Cartilage. – 2014. – № 12. – P. 2017–2024.