Отчёт о результатах экспериментального изучения свойств пептида IPH-AEN как средства для нормализации функций костно-хрящевой ткани

Наиболее часто используемый вид лабораторных животных для исследований свойств пептидов, рекомендуемый МЗ РФ в Руководстве по проведению доклинических исследований лекарственных средств [Миронов А.Н., Бунатян Н.Д. и др., 2012], — это крысы, так как процессы фармакокинетики схожи с таковыми у человека.

Для изучения свойств пептида IPH-AEN нами была создана модель повреждения вертлужной впадины. Получение модели линейного сквозного костно-хрящевого повреждения вертлужной впадины (патент РФ № 2470378) выполняли в стерильных условиях под общим комбинированным наркозом: золетил 100 («Virbac Sante Animale», Франция) 8 мг/кг, ксилазин 2 % («Alfasan International B.V.», Голландия) 4.0 мг/кг, внутримышечно. В области шейки бедренной кости вскрывали капсулу сустава и производили вывих головки из вертлужной впадины. Далее с помощью хирургической пилы толщиной 0,2 мм производили поперечный пропил вертлужной впадины со стороны ее дорсальной части до уровня середины суставной ямки, после чего выполняли резекцию головки и шейки бедренной кости.

Нами было исследовано 40 крыс в возрасте 13,8±1,2 месяца и весом 423,1±7,5 г,  которым были созданы условия мышечной травмы.

Световой день составлял 12 часов. Для питания животных использовались полноценные корма для грызунов с дополнительным прикормом в виде фруктов и овощей. Вода употреблялась животными самостоятельно из поилок. Пища и жидкость принимались животными ad libitum. Текущая уборка клеток осуществлялась ежедневно. Генеральная уборка с дезинфекцией клеток выполнялась еженедельно. Все процедуры содержания животных, проведения манипуляций и тестирования полученных данных проводились в соответствии со стандартами ISO 10993-1-2003 и ГОСТ РИСО 10993.2-2006.

Крысы были разделены на 2 группы – контрольную (n=20) и основную (n=20). Крысам основной группы перорально через пипетку-дозатор, позволяющую контролировать объём и факт потребления жидкости, вводился раствор, состоящий из воды для инъекций в дозировке 1 мл, в которой растворен лиофилизированный порошок пептидов IPH-AEN в концентрации 0,60 микрограммов (мкг) в расчете на массу тела крысы в сутки (минимальная дозировка, при которой отмечаются признаки улучшения показателей после применения пептидов), на протяжении 14 дней. Препарат вводился per os прямо в ротовую полость под наблюдением и отслеживанием его проглатывания.

Спустя 14 суток крыс умертвляли, затем удаляли капсулу сустава, фиксировали   с   помощью   погружения   в   раствор 4% параформальдегида в фосфатном буфере (PBS рН = 7,3) в течение 24 часов при температуре 4^оС.  Изготавливали срезы толщиной 20 мкм с помощью криотома фирмы Leica модели CM 1510S (Германия). Затем срезы монтировались на предметном стекле и окрашивали гематоксилином  и  эозином.

Для исследования нами применялся микроскоп Olympus IX81. Микроскоп был снабжен цифровой камерой Olympus DP72 (Япония), соединенной с персональным компьютером. Фото- и видеофиксация технологических процессов (процессов эксперимента) с животными не проводилась в соответствии с принципами биомедицинской этики и в связи с отсутствием разрешения этического комитета.

Для оценки достоверности различия результатов, полученных в группах до применения лекарственных препаратов, по сравнению с группами после применения лекарственных препаратов использовали критерий Даннета. Если данные подчинялись нормальному распределению, различия в средних определялись с помощью критерия Стъюдента (t).

В ходе эксперимента было показано, что применение пептида IPH-AEN достоверно увеличивает репаративные свойства хрящевой ткани. При применении данного пептида отмечалось заполнение зоны повреждения грануляционной тканью с большим количеством тонкостенных капилляров, выстланных изнутри уплощенными ядросодержащими клетками – эндотелиоцитами. На поверхности травмированных костных трабекул располагались активные остеобласты, встречались немногочисленные остеокласты. В костной ткани отломков вблизи линии повреждения определялись ядросодержащие остеоциты, на периостальной и эндостальной поверхности – активные остеобласты. В то время как в контрольной группе было установлено, что диастаз между отломками был заполнен фибрином и тканевым детритом, включающим поля некротически измененных клеток с выраженным криопикнозом, кариорексисом либо кариолизисом. В клеточном составе преобладали клетки, характерные для воспалительной стадии репаративного процесса, — сегментоядерные лейкоциты и мононуклеарные фагоциты (Рисунок 1).

Эти данные свидетельствуют о том, что применение пептида IPH-AEN улучшает репарацию и регенерацию костно — хрящевой ткани после повреждения, снижает степень воспалительной реакции, другими словами пептид IPH-AEN обладает высокой репаративной и регенераторной активностью в отношении костно- хрящевой ткани и имеет противовоспалительные свойства, а также оказывает противодействие дегенеративным процессам в хрящевой ткани суставов тем самым обеспечивая профилактику заболеваний суставов.

В ходе эксперимента нами была выявлена общая площадь жизнеспособных клеток (Рисунок 2).

Применение пептида IPH-AEN увеличивает общую площадь жизнеспособных клеток в 2,7 раз. Эти данные подтверждают тот факт, что применение пептида IPH-AEN способствует улучшению регенерации и восстановлению костно — хрящевой ткани, синтезу хрящевых клеток, что обеспечивает быструю регенерацию костной ткани, улучшает выработку коллагена и гиалуроновой кислоты после повреждения на экспериментальной модели.

Таким образом, применение пептида IPH-AEN улучшает репарацию и регенерацию костно — хрящевой ткани после повреждения, снижает степень воспалительной реакции, другими словами пептид IPH-AEN обладает высокой репаративной и регенераторной активностью в отношении костно- хрящевой ткани и имеет противовоспалительные свойства, а также оказывает противодействие дегенеративным процессам в хрящевой ткани суставов тем самым обеспечивая профилактику заболеваний суставов.

Применение пептида IPH-AEN увеличивает общую площадь жизнеспособных клеток в 2,7 раз. Эти данные подтверждают тот факт, что применение пептида IPH-AEN способствует улучшению регенерации и восстановлению костно — хрящевой ткани, синтезу хрящевых клеток, что обеспечивает быструю регенерацию костной ткани, улучшает выработку коллагена и гиалуроновой кислоты после повреждения на экспериментальной модели.

1. Забелло Т.В., Мироманов А.М., Мироманова Н.А. Генетические аспекты развития остеоартроза // Фундаментальные исследования. – 2015. – № 1-9. – С. 1970-1976
2. Линькова Н.С., Дробинцева А.О., Орлова О.А., Кузнецова Е.П., Полякова В.О., Кветной И.М., Хвинсон В.Х. Пептидная регуляция функций фибробластов кожи при их старении in vitro // Клеточные технологии в биологии и медицине. – 2016. — №1. – С. 40-44.
3. Хавинсон В.Х. Пептидная регуляция старения. СПб.: Наука, 2009. — 50 с.
4. Arshad H., Ahmad Z., Hasan S.H. Gliomas: correlation of histologic grade, Ki67 and p53 expression with patient survival // Asian Pac J Cancer Prev. – 2010. – Vol. 11. – N 6. – P. 1637-1640;
5. Trzeciak T. MicroRNAs: Important Epigenetic Regulators in Osteoarthritis / T. Trzeciak, M. Czarny-Ratajczak // Curr. Genomics. – 2014. – № 6. – P. 481–484.
6. Tsezou A. Osteoarthritis year in review 2014: genetics and genomics // Osteoarthritis Cartilage. – 2014. – № 12. – P. 2017–2024.