Отчёт о результатах экспериментального изучения свойств пептида IPH-AGAA как средства для нормализации функций системы мышц

Наиболее часто используемый вид лабораторных животных для исследований свойств пептидов, рекомендуемый МЗ РФ в Руководстве по проведению доклинических исследований лекарственных средств [Миронов А.Н., Бунатян Н.Д. и др., 2012], — это крысы, так как процессы фармакокинетики схожи с таковыми у человека.

Для изучения свойств пептида IPH-AGAA нами была создана модель мышечной травмы. В целях вызова мышечной травмы нами был введен препарат нотексин в четырехглавую мышцу левой конечности крыс. Нотексин — пептид из 119 аминокислот из яда змеи Notechis scutatus, с молекулярной массой 13574 Да. Растворим в воде и солевых растворах. Обладает сильной миотоксической активностью.

(Первичная структура:

H2NNLVQFSYLIQCANHGKRPTWHYMDYGCYCGAGGSGTPVDELDRCCKIHDDCYDEAGKKGCFPKMSAYDYYCGENGPYCRNIKKKCLRFVCDCDVEAAFCFAKAPYNNANWNIDTKKRCQ-COOH).

Нами было исследовано 40 крыс в возрасте 14,1±1,2 месяца и весом 408,9±8,9 г,  которым были созданы условия мышечной травмы.

Световой день составлял 12 часов. Для питания животных использовались полноценные корма для грызунов с дополнительным прикормом в виде фруктов и овощей. Вода употреблялась животными самостоятельно из поилок. Пища и жидкость принимались животными ad libitum. Текущая уборка клеток осуществлялась ежедневно. Генеральная уборка с дезинфекцией клеток выполнялась еженедельно. Все процедуры содержания животных, проведения манипуляций и тестирования полученных данных проводились в соответствии со стандартами ISO 10993-1-2003 и ГОСТ РИСО 10993.2-2006.

Крысы были разделены на 2 группы – контрольную (n=20) и основную (n=20). Крысам основной группы перорально через пипетку-дозатор, позволяющую контролировать объём и факт потребления жидкости, вводился раствор, состоящий из воды для инъекций в дозировке 1 мл, в которой растворен лиофилизированный порошок пептидов IPH-AGAA в концентрации 0,58 микрограммов (мкг) в расчете на массу тела крысы в сутки (минимальная дозировка, при которой отмечаются признаки улучшения показателей по многолетнему опыту применения пептидов), на протяжении 14 дней. Препарат вводился per os прямо в ротовую полость под наблюдением и отслеживанием его проглатывания.

На 13 сутки проводили забор венозной крови и исследовали уровень провоспалительных  (TNF-α, IL-1-β) и противовоспалительных (Il-10) цитокинов. Определение уровня цитокинов TNF-α, IL-1-β, IL-10 проводилось с помощью реагентов «Rayde Biotech, Inc.» (США) на автоматическом биохимическом и иммуноферментный анализатор ChemWell® 2910 (Combi) (Awareness Technology, Inc., США). Основой метода определения уровня цитокинов является твердофазный «сэндвич»-метод (вариант иммуноферментного анализа).

Спустя 14 суток крыс умертвляли, затем удаляли четырехглавую мышцу левой конечности, фиксировали   с   помощью   погружения   в   раствор 4% параформальдегида в фосфатном буфере (PBS рН = 7,3) в течение 24 часов при температуре 4^оС.  Изготавливали срезы толщиной 20 мкм с помощью криотома фирмы Leica модели CM 1510S (Германия). Затем срезы монтировались на предметном стекле и окрашивали гематоксилином  и  эозином.

Для исследования нами применялся микроскоп Olympus IX81. Микроскоп был снабжен цифровой камерой Olympus DP72 (Япония), соединенной с персональным компьютером. Фото- и видеофиксация технологических процессов (процессов эксперимента) с животными не проводилась в соответствии с принципами биомедицинской этики и в связи с отсутствием разрешения этического комитета.

Для оценки достоверности различия результатов, полученных в группах до применения лекарственных препаратов, по сравнению с группами после применения лекарственных препаратов использовали критерий Даннета. Если данные подчинялись нормальному распределению, различия в средних определялись с помощью критерия Стъюдента (t).

В ходе эксперимента было показано, что применение пептида IPH-AGAA достоверно положительно влияет на снижение хронического иммунного воспаления, развившегося в ответ на мышечную травму, и повышение противовоспалительного ответа. Данные приведены в таблице 1.

Эти данные позволяют сделать вывод, что пептид IPH-AGAA обладает противовоспалительным действием в отношении повреждения мышечной ткани и тем самым способствует улучшению регенерации повреждённых мышц.

В ходе эксперимента нами было обнаружено, что в контрольной группе  в  срезе четырехглавой мышцы в контрольной группе незначительны участки структурированности волокон, исчерченности, что составило площадь восстановления мышечного волокна всего 36,8±1,2% и свидетельствует о высоком риске развития контрактур и снижения эластичности мыщц. В то время как у крыс, которым вводили пептид IPH-AGAA, наблюдается структурированность волокон, исчерченность и площадь восстановления мышечного волокна составила 89,4±1,4%, что в 2,4 раза больше, чем без применения пептида IPH-AGAA (Рисунок  1).

Таким образом, применение пептида IPH-AGAA снижает степень воспалительного процесса при повреждении мышечной ткани, способствует улучшению регенерации и восстановлению мышечных волокон, предупреждает развитие контрактур и снижения эластичности мышц на экспериментальной модели. Эти данные свидетельствуют о том, что применение пептида IPH-AGAA оптимизирует обмен веществ в клетках мышечной ткани, оказывает антиоксидантное действие, при физических нагрузках препятствует повреждению клеток мышечной ткани свободными радикалами, обеспечивает интенсивное и продолжительное питание клеток мышечной ткани, оказывает стимулирующее действие на мышцы в условиях гипоксии и увеличивает эластичность и упругость мышц.

Таким образом, пептид IPH-AGAA обладает противовоспалительным действием в отношении повреждения мышечной ткани и тем самым способствует улучшению регенерации повреждённых мышц, что проявляется цитостатическим и противовоспалительным действием в отношении клеток мышц по данным экспериментальных исследований.

Применение пептида IPH-AGAA снижает степень воспалительного процесса при повреждении мышечной ткани, способствует улучшению регенерации и восстановлению мышечных волокон, предупреждает развитие контрактур и снижения эластичности мышц на экспериментальной модели. Эти данные свидетельствуют о том, что применение пептида IPH-AGAA оптимизирует обмен веществ в клетках мышечной ткани, оказывает антиоксидантное действие, при физических нагрузках препятствует повреждению клеток мышечной ткани свободными радикалами, обеспечивает интенсивное и продолжительное питание клеток мышечной ткани, оказывает стимулирующее действие на мышцы в условиях гипоксии и увеличивает эластичность и упругость мышц.

1. Миронов А.Н., Бунатян Н.Д. и др. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств// Коллектив авторов. — М.: Гриф и К, 2012. — 944 с.
2. Хавинсон В.Х., Кузник Б.И., Линькова Н.С., Проняева В.Е. Влияние пептидных регуляторов и цитокинов на продолжительность жизни и возрастные изменения системы гемостаза. // Успехи физиол. наук. 2013. Т. 44. № 1. С.39-53.
3. Хавинсон В.Х. Пептидная регуляция старения. СПб.: Наука, 2009. — 50 с.
4. Ahmetov II, Druzhevskaya AM, Astratenkova IV, Popov DV, Vinogradova OL, Rogozkin VA. The ACTN3 R577X polymorphism in Russian endurance athletes. Br J Sports Med. 2010 Jul;44(9):649-52.
5. Kathryn R Wagner, MD, PhD and Julie S Cohen, ScM, CGC. Myostatin-Related Muscle Hypertrophy// National Center for Biotechnology Information, U.S. National Library of Medicine- 2018.- № 4- 35-39.

Meienberg J, Rohrbach M, Neuenschwander S, Spanaus K, Giunta C, Alonso S, Arnold E, Henggeler C, Regenass S, Patrignani A, Azzarello-Burri S, Steiner B, Nygren AO, Carrel T, Steinmann B, Mátyás G. Hemizygous deletion of COL3A1, COL5A2, and MSTN causes a complex phenotype with aortic dissection: a lesson for and from true haploinsufficiency. Eur J Hum Genet. 2010;18:1315–21.