В настоящее время большой интерес представляет изучение свойств пептидов [Dudgeon W.D. et al., 2016]. Пептиды имеют ту же структуру, что и белки (протеины), но размер этих молекул меньше. Важно также отметить, что короткие пептиды, являясь естественным продуктом обмена веществ, присутствующих в организме, не могут быть выявлены в крови или моче. В связи с этим интерес представляет изучение свойств отдельных структур на клеточных культурах.
Пептид IPH- AVN содержит низкомолекулярный пептид, обладает ангио – и вазопротекторными свойствами и оказывает нормализующее действие на сосудистую систему.
Экспериментальные исследования показали, что пептид IPH- AVN регулирует процессы метаболизма в сосудах, снижает проницаемость сосудистой стенки, повышает резервные возможности организма, что позволяет предполагать эффективность применения пептида IPH- AVN для нормализации функций сосудистой системы человека при нарушениях различного генеза.
В связи с этим целью нашего исследования было изучение ангиопротекторных и других свойств пептида.
Характеристика эксперимента
Наиболее часто используемый вид лабораторных животных для исследований свойств пептидов, рекомендуемый МЗ РФ в Руководстве по проведению доклинических исследований лекарственных средств [Миронов А.Н., Бунатян Н.Д. и др., 2012], — это крысы, так как процессы фармакокинетики схожи с таковыми у человека.
Для изучения свойств пептида IPH- AVN нами была создана модель мышечной травмы с поражением сосудистого русла. В целях вызова мышечной травмы нами был введен препарат нотексин в четырехглавую мышцу левой конечности крыс, а также применялись аппликации солевых растворов (хлористого железа) для создания дополнительных очагов тромбоза. Нотексин — пептид из 119 аминокислот из яда змеи Notechis scutatus, с молекулярной массой 13574 Да. Растворим в воде и солевых растворах. Обладает сильной миотоксической активностью.
(Первичная структура:
H2NNLVQFSYLIQCANHGKRPTWHYMDYGCYCGAGGSGTPVDELDRCCKIHDDCYDEAGKKGCFPKMSAYDYYCGENGPYCRNIKKKCLRFVCDCDVEAAFCFAKAPYNNANWNIDTKKRCQ-COOH).
Нами было исследовано 50 крыс в возрасте 14,3±1,1 месяца и весом 409,3±8,3 г, которым были созданы условия мышечной травмы с поражением сосудистого русла.
Световой день составлял 12 часов. Для питания животных использовались полноценные корма для грызунов с дополнительным прикормом в виде фруктов и овощей. Вода употреблялась животными самостоятельно из поилок. Пища и жидкость принимались животными ad libitum. Текущая уборка клеток осуществлялась ежедневно. Генеральная уборка с дезинфекцией клеток выполнялась еженедельно. Все процедуры содержания животных, проведения манипуляций и тестирования полученных данных проводились в соответствии со стандартами ISO 10993-1-2003 и ГОСТ РИСО 10993.2-2006.
Крысы были разделены на 2 группы – контрольную (n=25) и основную (n=25). Крысам основной группы перорально через пипетку-дозатор, позволяющую контролировать объём и факт потребления жидкости, вводился раствор, состоящий из воды для инъекций в дозировке 1 мл, в которой растворен лиофилизированный порошок пептидов IPH- AVN в концентрации 0,58 микрограммов (мкг) в расчете на массу тела крысы в сутки (минимальная дозировка, при которой отмечаются признаки улучшения показателей по многолетнему опыту применения пептидов), на протяжении 14 дней. Препарат вводился per os прямо в ротовую полость под наблюдением и отслеживанием его проглатывания.
Спустя 14 суток крыс умертвляли, затем удаляли четырехглавую мышцу левой конечности, фиксировали с помощью погружения в раствор 4% параформальдегида в фосфатном буфере (PBS рН = 7,3) в течение 24 часов при температуре 4оС. Изготавливали срезы толщиной 20 мкм с помощью криотома фирмы Leica модели CM 1510S (Германия). Затем срезы монтировались на предметном стекле и окрашивали гематоксилином и эозином.
Для исследования нами применялся микроскоп Olympus IX81. Микроскоп был снабжен цифровой камерой Olympus DP72 (Япония), соединенной с персональным компьютером. Фото- и видеофиксация технологических процессов (процессов эксперимента) с животными не проводилась в соответствии с принципами биомедицинской этики и в связи с отсутствием разрешения этического комитета.
Статистическая обработка
Для оценки достоверности различия результатов, полученных в группах до применения лекарственных препаратов, по сравнению с группами после применения лекарственных препаратов использовали критерий Даннета. Если данные подчинялись нормальному распределению, различия в средних определялись с помощью критерия Стъюдента (t).
Результаты исследования
В срезах четырехглавой мышцы крыс контрольной группы были выявлены очаги ишемии в объеме 75,3±1,2% распространения от всех площади и очаги тромбозов в объеме 66,7±1,2% распространения от всех площади. В то время как у крыс основной группы были выявлены очаги ишемии в 2,3 раза достоверно меньше, чем у крыс контрольной группы, что составило 33,2±0,9% распространения от всех площади и достоверно меньше в 1,8 раз очагов тромбозов в объеме 36,2±1,2% распространения от всех площади, p<0,05 по сравнению с контрольной группой. Этот факт доказывает, что применение пептида IPH- AVN способствует репарации сосудистого русла после повреждения, снижению тромбообразования на основе данных экспериментальной модели.
При изучении капиллярного русла нами было обнаружено, что отмечались участки некротизированных эндотелиоцитов, накопление амилоидных бляшек у крыс контрольной группы. Все эти морфологические показатели свидетельствуют о резком снижении репаративных возможностей внутри клеток. В 1,6 раз в меньшей степени были обнаружены участки некротизированных эндотелиоцитов, накопление амилоидных бляшек у крыс основной группы. Эти данные подтверждают, что применение пептида IPH- AVN способствует ангиогенезу при повреждении сосудистого русла.
Для оценки нормализующего действия пептида IPH- AVN нами была изучена площадь сечения артериального русла (Рисунок 1).
Таким образом, нами было обнаружено, что у крыс, получавших пептид IPH- AVN площадь сечения артериального русла в 1,8 раз меньше, чем у крыс контрольной группы. Учитывая резкое снижение репаративных возможностей эпителиоцитов, можно сделать вывод, что такое снижение площади артериального русла свидетельствует о более низкой необходимости компенсаторных реакций, которые проявляются увеличением площади сечения сосудов артериального русла при повреждении и подтверждают высокую репаративную активность пептида IPH- AVN в отношении способности восстанавливать повреждение сосудистой стенки.
Соответственно, пептид IPH- AVN обладает ангиопротекторным действием и повышает адаптационную способность эндотелиоцитов у крыс с повреждением сосудистого русла по экспериментальным данным.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Таким образом, применение пептида IPH- AVN способствует репарации сосудистого русла после повреждения, снижению тромбообразования на основе данных экспериментальной модели.
Применение пептида IPH- AVN способствует ангиогенезу при повреждении сосудистого русла. Пептид IPH- AVN имеет высокую репаративную активность в отношении способности восстанавливать повреждение сосудистой стенки. Пептид IPH- AVN обладает ангиопротекторным действием и повышает адаптационную способность эндотелиоцитов у крыс с повреждением сосудистого русла по экспериментальным данным.
Литература
- Васильев И.А., Ступак В.В., Черных В.А., Зайдман А.М., Половников Е.В., Черных Е.Р., Шевела Е.Я., Дергилев А.П. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ МОДЕЛИ СОСУДИСТЫХ ПОРАЖЕНИЙ ГОЛОВНОГО МОЗГА (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ) // Успехи современного естествознания. – 2015. – № 1-3. – С. 366-369
- Линькова Н.С., Дробинцева А.О., Орлова О.А., Кузнецова Е.П., Полякова В.О., Кветной И.М., Хвинсон В.Х. Пептидная регуляция функций фибробластов кожи при их старении in vitro // Клеточные технологии в биологии и медицине. – 2016. — №1. – С. 40-44.
- Хавинсон В.Х. Пептидная регуляция старения. СПб.: Наука, 2009. — 50 с.
- Orekhov A.N., Andreeva E.R., Bobryshev Y.V. Cellular mechanisms of human atherosclerosis: Role of cell-to-cell communications in subendothelial cell functions // Tissue Cell. — 2016. — V. 48. — N 1. — P. 25-34.